Revista Científica Unanchay ISSN 2953-6707
Volumen 1. Número 1. Año 2022.
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Ubicación e identificación de microorganismos capaces de
autoreparar fisuras en mezclas de concreto
Location and identification of microorganisms with the capacity to self-healing
cracks in concrete mixes
Orlando Gabriel Da Silva De Sousa 1
1
Resumen:
El concreto es el material de construcción más utilizado en el mundo, pero es propenso
a las grietas, exponiendo así a las bacterias que habitan en él principalmente a elementos
como el agua. Se mezcla el concreto tradicional con cepas de la bacteria del género
Bacillus que en su forma esporulada pueden habitar incluso en ambientes tan hostiles
como cráteres de volcanes activos. La humedad que penetra las fisuras activas a los
microorganismos que comienzan a alimentarse del lactato de calcio presentes en la
mezcla, y como producto final de su digestión secretan piedra caliza, autoreparando
dichas fisuras. La investigación cuenta con un diseño observacional bajo una tipología
documental de campo, inicialmente se recolectaron muestras significativas de suelo, en
los terrenos de la empresa Venezolana de Cementos S.A.C.A., donde se tomaron un
total de ocho (8) muestras de forma aleatoria en gran parte del cerro gordo desde la cota
620 hasta la cota 790, de suelo y roca en estado natural sobre la superficie del yacimiento
perteneciente a la formación geológica Carorita, las cuales, poseen un gran porcentaje
de carbonato de calcio, sílice y alúmina según datos aportados por la sala de ingeniería
de la empresa. Los resultados de los análisis realizados indican que las bacterias
presumiblemente tienen la capacidad de adaptarse al medio, multiplicarse y
potencialmente, en presencia de lactato de calcio, pudieran liberar como producto de su
metabolismo, carbonato de calcio, material que serviría para auto reparar fisuras.
Palabras clave: Bacterias, concreto, autorreparación, fisuras.
Abstract:
Concrete is the most widely used construction material in the world, but it is prone to
cracking, thus exposing the bacteria that inhabit it mainly to elements such as water.
Traditional concrete is mixed with strains of bacteria of the Bacillus genus, which in their
1
Ingeniero Civil (UCLA) / Ingeniero Mecánico (UNEXPO). Docente Universitario UCLA / UNEXPO.
Autor de correspondencia: orlandogabrieldasilva@gmail.com
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sporulated form can even inhabit environments as hostile as craters of active volcanoes.
The humidity that penetrates the fissures activates the microorganisms that begin to feed
on the calcium lactate present in the mixture, and as a final product of their digestion they
secrete limestone, self-repairing said fissures. The research has an observational design
under a documentary field typology, initially significant soil samples were collected on the
land of the company Venezolana de Cementos S.A.C.A. A total of eight (8) samples were
taken randomly in a large part of Cerro Gordo from elevation 620 to elevation 790, of soil
and rock in a natural state on the surface of the deposit belonging to the Carorita
geological formation, which have a large percentage of calcium carbonate, silica and
alumina according to data provided by the company's engineering room. The results of
the analyzes carried out indicate that the bacteria presumably have the ability to adapt to
the environment, multiply and potentially, in the presence of calcium lactate, could release
calcium carbonate as a product of their metabolism, a material that would serve to self-
repair fissures.
Keywords: Bacteria, concrete, self-healing, fissures.
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Introducción
Entre los primeros hallazgos obtenidos por los científicos está que existen varios
gases de tipo invernadero responsables del calentamiento que el sector de la
construcción emite en una variedad de formas. La mayoría provienen de vehículos,
fábricas, construcción, y producción de electricidad. Otra forma de contribuir con el
calentamiento global o incremento de la temperatura ambiental es mediante la emisión
de Dióxido de Carbono, el cual se estima que 5% de éste proviene de la producción de
cemento (Chatham House, 2018). El concreto es un material aglomerante, que a medida
que pasan los años de servicio presenta diversas fallas que van desde fisuras en las
paredes de una edificación, hasta las que puedan comprometer la resistencia del
material, afectando la integridad de la superestructura (Gutiérrez, 2021).
Estas pueden derivar desde una sencilla molestia para el usuario, al colapso parcial o
total de la estructura, pudiendo resultar en heridas, lesiones e incluso la muerte de seres
humanos. Actualmente, no se evidencia la importancia que tiene el empleo de
biomateriales en la ingeniería civil, limitándose exclusivamente a producir grandes
cantidades de concreto sin importar las consecuencias futuras sobre el medio ambiente,
y por lo tanto en el ser humano. La microbiología aplicada, mediante un proceso natural
que se conoce como biomineralización, utilizado para evitar el desprendimiento, la
pulverización y la descamación de las fachadas de piedra calcárea ocasionados por la
contaminación y la exposición natural al clima; pudiera contribuir a encontrar una posible
solución.
El Carbonato de Calcio de origen bacteriano se aplica como aditivo biológico para
mejorar las propiedades físico-mecánicas (tamaño del poro, resistencia y durabilidad) y
conductividad térmica del concreto armado, sin causar efectos secundarios, ni
coloración, formación de sales residuales o interferencia con el intercambio gaseoso del
material con la atmósfera. Igualmente, la aparición de estas fisuras, en muchas
ocasiones obliga a que los ingenieros exijan mayores cantidades de acero reforzado en
sus cálculos, sobre diseñando la estructura, lo que incurre en un incremento en el peso
de la estructura y el consecuente aumento en los costos finales de producción (Kadapure
y Deshannavar, 2021).
Existe además el caso de detección tardía de la falla que por corrosión deteriora el
material por una reacción química de tipo Óxido-Reducción, disminuyendo el área de la
sección del acero (González, 2020), por lo tanto, crea una disminución de la capacidad
portante del miembro que se está considerando, que genera consecuencias no
solamente en el ámbito económico, sino también en la seguridad y bienestar del ser
humano. Del mismo modo, la resistencia y durabilidad de los elementos estructurales en
concreto armado que presentan fisuras ocasionadas por factores ambientales, mal
curado, retracción, dosificación incorrecta, entre otros; lo que permite la entrada de
humedad en éste y al llegar al acero de refuerzo se corroe, acelerando la aparición de
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este tipo de daño.
Las grietas en el concreto, si bien, disminuyen proporcionalmente en la medida en que
la obra sea correctamente ejecutada, difícilmente pueden ser eliminadas totalmente. Es
por eso que se recurre al estudio patológico correspondiente, y este determinará la
terapia más adecuada para el problema (reparación, restauración, refuerzo) o la
demolición parcial o total del elemento sometido a cualquier proceso de corrosión, sin
embargo estas soluciones suelen ser costosas. El agrietamiento es una de las principales
causas de deterioro del hormigón, lo que permite la entrada de productos químicos y
puede provocar la pérdida de las propiedades físico-mecánicas y de durabilidad de las
estructuras de hormigón.
Para proteger, reparar y rehabilitar estructuras de hormigón, se ha practicado
comúnmente la aplicación de diferentes agentes de recubrimiento y selladores de
superficie, agentes aglutinantes, así como adhesivos (Sotomayor ,2020). Aunque tales
técnicas han sido aplicables en su mayoría, debido a su diferencia de mecanismo
inherente, los principales desafíos, como la delaminación y la falta de rentabilidad, han
resultado en la búsqueda de métodos alternativos de sellado de grietas o autocuración.
Uno de los nuevos mecanismos de autorreparación es el uso de la precipitación de calcita
inducida por bacterias en mezclas de hormigón para curar las grietas del hormigón.
En esta técnica, la mineralización bacteriana (biomineralización) se realiza mediante
la descomposición de la urea y el calcio para producir carbonato de calcio (CaCO3), que
puede rellenar grietas (González et al., 2018). Para revisar los mecanismos que
gobiernan esta precipitación, este artículo tiene como objetivo presentar un análisis en
profundidad de la biomineralización, la precipitación de CaCO3, las propiedades físico-
mecánicas, de durabilidad y microestructurales del concreto bacteriano. Para ello, se han
revisado artículos de investigación y se recopilan, proporcionan y analizan sus datos,
incluidos los tipos y dosis de bacterias, las proporciones de la mezcla, así como el
resultado de las pruebas mecánicas y de durabilidad.
Según esta revisión, se encuentra que la biomineralización depende principalmente
de factores como el método de aplicación y la preservación constante de las bacterias
vivas. Además, se encuentra que el impacto ambiental del concreto bacteriano está
directamente relacionado con el contenido de urea en la mezcla de concreto. En las
últimas décadas, las principales técnicas de reparación, como el uso de curación
autógena de partículas de cemento sin reaccionar (especialmente en estructuras de
concreto de ultra alto desempeño) y la adición de resinas poliméricas (por ejemplo, epoxi,
poliéster, y viniléster), adhesivos, productos químicos impermeabilizantes y agentes
aglutinantes alternativos (p. ej., materiales activados con álcali) (Ghosh, 2008).
Sin embargo, en numerosos casos, la falta de rentabilidad, las altas implicaciones
ambientales, la falta de una zona de transición interfacial (ITZ) coherente y homogénea,
los problemas de delaminación (especialmente para materiales basados en polímeros) y
los desafíos para aplicaciones reales in situ (p. ej., manipulación de activador líquido para
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materiales activados con álcali) han creado un dilema para elegir la técnica de reparación
más adecuada. Aunque recientemente se han realizado algunos estudios de revisión
sobre la producción y aplicación de hormigón bacteriano, por ejemplo, Rauf (2020) y
Ehrlich (2019), la mayoría de ellos se han centrado principalmente en el efecto directo
de la inclusión bacteriana en las propiedades mecánicas del hormigón.
Además, ignoraron por completo las propiedades microbiológicas y de durabilidad y la
caracterización del concreto bacteriano, y simplemente informaron las propiedades
mecánicas mejoradas como resultado de la incorporación de cepas bacterianas.
Martirena (2019), por ejemplo, revisó el mecanismo de autocuración bioinfluenciado en
el hormigón y se centró principalmente en evaluar las pruebas realizadas y descubrir
lagunas en la investigación en esta área, pero no pudo proporcionar un análisis en
profundidad de las propiedades del hormigón. (Gupta 2007) reviso y destaco cuatro
aspectos clave que determinan la eficacia de las propiedades de autorreparación
bacterianas, incluida la encapsulación, la supervivencia de las cápsulas durante el
mezclado del concreto, el efecto de la adición de bioagentes en las propiedades del
concreto y la capacidad de sellado.
No obstante, en este estudio de revisión no se proporcionaron la durabilidad mecánica
ni las propiedades microestructurales del hormigón que contiene agentes bacterianos.
La presente investigación se desarrolla en los laboratorios de microbiología del decanato
de Ciencias de la Salud de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, ubicada
en el centro de la ciudad de Barquisimeto, estado Lara, Venezuela. Luego de estudiar
las posibles zonas en donde se presume la presencia de microorganismos capaces de
producir un material similar a la calcita (material rocoso de alta resistencia), se determinó
estudiar suelos pertenecientes a tres lugares claves como lo son: las minas de material
rocoso para la fabricación de cemento ubicada al norte de la ciudad de Barquisimeto, en
la intercomunal Barquisimeto-Duaca, terrenos pertenecientes a la empresa venezolana
de cementos SACA.
Se seleccionó una calera de cal ubicada en la población de Yaritagua, estado
Yaracuy, perteneciente a Maxical C.A., así como las arenas usadas para trabajos de
albañilería que se extraen en la cuenca del Rio Turbio, en la intercomunal Barquisimeto-
Acarigua las cuales son comercializadas por la arenera Rio Turbio CA. En ese sentido,
el presente artículo tiene el propósito de determinar la presencia de microorganismos
autor reparadores en el concreto. Este estudio de investigación primero proporciona un
análisis en profundidad del fondo microbiológico del concreto bacteriano, para luego
enfocarse en los tipos y la cantidad de cada variable de la mezcla, su proporción y los
respectivos resultados sobre las propiedades físico-mecánicas y de durabilidad. Al
hacerlo, se evaluaron estudios de investigación y se recopilaron y proporcionaron sus
datos de diseño de mezcla, así como los resultados de las pruebas.
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Metodología
La investigación cuenta con un diseño observacional bajo una tipología documental
de campo, donde inicialmente se recolectaron muestras significativas de suelo en cada
uno de los lugares escogidos, en el caso de los terrenos de la empresa Venezolana de
Cementos SACA. se tomaron un total de ocho (8) muestras de forma aleatoria y en gran
parte de la extensión del cerro gordo desde la cota 620 hasta la cota 790, de suelo y roca
en estado natural sobre la superficie del yacimiento perteneciente a la formación
geológica Carorita. Estas muestras poseen un gran porcentaje de carbonato de calcio,
sílice y alúmina según datos aportados por la sala de ingeniería de la empresa. En el
caso de la calera de cal se tomó una (1) muestra representativa de la extracción en el
yacimiento, esta presenta una gran pureza en carbonato de calcio. Por último, se tomó
una (1) muestra de las arenas extraídas en la cuenca del rio Turbio para su análisis.
Figura 1
Toma de muestra en venezolana de cementos S.A.C.A.
Fuente: Fotografía tomada por el autor (2022).
Las muestras recolectadas para ser estudiadas microbiológicamente se recogieron en
frascos de vidrio de fácil esterilización, boca ancha y de capacidad de 400gr,
cuidadosamente lavados y aclarados, debidamente tapados y rotulados según el sector
donde se tomó. Los frascos utilizados para la toma de muestras se mantuvieron con las
tapas cerradas y se retiró hasta el momento de tomar las muestras para evitar
contaminación en la misma. Al momento de encontrar el sitio apropiado para la toma de
la muestra con la ayuda de una piqueta se desprendió granos de la superficie, se abrió
el frasco y tomó la muestra, en este caso perturbada uno, de aproximadamente 350gr
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con una espátula dejando un espacio de aire libre dentro de la botella de 2,5cm para
facilitar la mezcla por agitación antes de proceder al estudio, luego se selló
herméticamente para mantener la humedad presente en el suelo. Por último fueron
rotuladas para su identificación según el sector donde se recolecto, cota y número de
muestra.
Las muestras fueron almacenadas y transportadas a temperatura ambiente, evitando
su exposición directa a la luz solar. Para este tipo de muestra no es necesario su análisis
y estudio en el laboratorio de forma inmediata, se puede almacenar un tiempo sin que
está presente distorsiones o cambios para el momento de su estudio. El análisis
Microbiológico permitirá conocer a partir de las muestras tomadas en la cementera, la
calera y la arenera; observar y analizar la presencia o ausencia de microorganismos
(para nuestro caso bacterias), para luego aislarlas con el uso de cultivos en agares
nutritivos o caldos enriquecidos, para posteriormente aplicar pruebas microbiológicas
para describirlas macroscópicamente, microscópicamente y determinar su capacidad de
auto reparar fisuras.
Preparación de las bases para medio de cultivo.
Medio Solido: Para el pre-enriquecimiento se utilizó como primer paso para verificar
la presencia o no microorganismos en las muestras tomadas, medios de Agar Sangre,
por ser un medio rico en nutrientes, siendo adecuado para el cultivo de los diversos
microorganismos exigentes. A continuación, se muestra los materiales y procedimiento
empleados para su preparación:
Agar Sangre (Bacto Blood Agar Base): Es un medio de infusión al cual se le añade
sangre para aislar y cultivar organismos fastidiosos. El pH, ligeramente ácido, de la base
favorece reacciones hemolíticas precisas.
Materiales: Mechero, recipiente, autoclave, varilla mezclada, placa Petri o tubo de
ensayo.
Procedimiento:
Se Suspende 40gr de Bacto Agar en 1 litro de agua destilada o desionizada y se
calienta hasta la ebullición para que se disuelva completamente.
Se esterilizó en autoclave durante 15 minutos a 15 lb de presión (121˚C), se enfrió a
45-50˚C.
Luego se añadió asépticamente un 5% de sangre estéril, desfibrada, a temperatura
ambiente y se mezcló homogéneamente.
Se dispensó en placas Petri o Tubos.
Por último, se dejó solidificar a temperatura ambiente.
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Figura 2
Muestra 1 en Agar Sangre
Fuente: Fotografía tomada por el autor (2022).
Caldo de cultivo de Pre-enriquecimiento.
Caldo Soya Tripticasa: Como era objeto de interés estudiar en que medio se
desarrollaban mejor las bacterias presentes en las muestras, se realizó un pre-
enriquecimiento en algunas de las muestras que resultaron de interés con caldo soya
Tricticasa, por ser un medio con muchos nutrientes, siendo adecuado para el cultivo de
los diversos microorganismos. A continuación se muestran los materiales y
procedimientos empleados para su preparación:
Materiales: Mechero, recipiente, autoclave, varilla mezclada, tubo de ensayo.
Figura 3.
Agar+ Tierra Muestras (imagen izquierda) y Caldo Soya Tricticasa (imagen derecha)
Fuente: Fotografía tomada por el autor (2022).
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Procedimiento:
Se disolvió la cantidad apropiada de medio deshidratado en 1 litro de agua destilada
o desionizada, calentando ligeramente para disolver por completo.
Se dispensó en tubos de ensayo.
Se esterilizó en autoclave durante 15 min a 15lb de presión/pul2 y (121˚C), se enfrió a
45-50˚C.
Cultivo primario no selectivo de las bacterias presentes en las muestras.
Las nueve (9) muestras tomadas identificadas anteriormente, las prepararon para ser
sembradas en los medios de cultivos enriquecidos, en este caso, no selectivo para
observar la presencia de los diversos microorganismos presentes en la esta, utilizando
en método de siembra en superficie.
Método de siembra en superficie.
Materiales: Aplicador de madera, agar sangre, placa de muestra, asa bacteriológica,
microscopio.
Procedimiento:
Este método se caracteriza porque durante la incubación las colonias crecen en la
superficie del agar. Para comenzar el proceso de aislamiento de las bacterias que se
presume están contenidas dentro de las muestras tomadas en los envases sellados
herméticamente, se procedió a mezclar de forma individual, independiente y alrededor
de toda la muestra con el uso de un aplicador de madera, luego se punzó en distintos
puntos de la misma para tomar una muestra representativa de cada envase.
Seguidamente, se procedió a sembrar directamente la muestra tomada por estriado y
agotamiento en agar sangre por ser un medio sólido con muchos nutrientes favorables
para el desarrollo de las bacterias, se incubaron por un periodo de 24 horas en una
incubadora a 37 ˚C de temperatura o hasta observar la presencia de colonias
bacterianas, esto se hace con el objetivo de encontrar colonias de bacterias viables,
aquella que es capaz de dividirse para dar lugar a la descendencia, y por tanto capaz de
generar colonias en la superficie del medio de cultivo, posterior al tiempo de cultivo con
ayuda de la asa bacteriológica se tomó una pequeña muestra de cada una de las colonias
de bacterias que fueron visibles a simple vista en el medio de agar sangre. El
procedimiento se describe en forma general:
Se utilizaron placas previamente preparadas y mantenidas a 37˚C,
que contienen el medio de cultivo solidificado (unos 20 ml/placa).
Se depositó en la superficie del agar 0,1 ml de la muestra o de cada
dilución.
Seguidamente, se procedió a extender dicha muestra sobre toda la
superficie de las placas, usando un asa bacteriológica estéril.
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Se esperó 2 o 3 minutos a que se secara el inóculo.
Se invirtieron las placas y se llevaron a incubar a 35 +/- 2˚C durante
24 horas.
Cultivo selectivo de las bacterias presentes en las muestras
Una vez que observaron que las colonias han crecido por incubación, era necesario
su confirmación y aislamiento selectivo, esto se realiza con técnicas de transferencias,
para estudiar una especie o forma de interés para el estudio en específico. En las
muestras provenientes de los medios líquidos de caldo soya tripticasa, el inóculo se tomó
agitando el suavemente el asa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por
tensión superficial en el extremo del filamento del asa de siembra. Si el medio era sólido
(caso agar sangre) y se encontraba en la superficie de la muestra a sembrar (placa Petri),
se tomó una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra.
Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta),
se hunde el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la misma.
Por último, se flamea la boca del tubo antes de taparlo y se coloca en el soporte
necesario.
Procedimiento de Transferencia
Para medio líquido:
Se tomaron los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin
sembrar y el que contiene los microorganismos a transferir, se toman con
una mano, con las bocas colocadas a la misma altura.
Se sostienen con los dedos índice, medio y anular apoyándolos en el
dedo meñique, y se los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base
para permitir la visualización de toda la superficie del cultivo.
Con el dedo pulgar e índice (como un lápiz) de la otra mano, se toma
la pipeta estéril, la aguja o asa (lupa) y se esterilizo en el mechero.
Se destaparon los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta
el asa, de la siguiente manera: el tapón del tubo más alejado del operador
(que es el que contiene la muestra) entre el dedo meñique y la palma de
la mano; el tapón del tubo más cercano al operador (que contiene el
medio de cultivo estéril) entre el meñique y el anular.
Se flamearon las bocas de los tubos, se tomó el inóculo; se sembró;
se flamearon nuevamente las bocas de los mismos y se taparon
respetando las procedencias de los tapones y se quema el asa.
En el caso que el inóculo proceda de un medio líquido, antes de realizar la
transferencia se debió agitar el tubo para poner en suspensión a los microorganismos
que pudieran estar depositados. Si la siembra se realizó en medio líquido, se agito el
tubo sembrado para distribuir homogéneamente el inóculo. Para realizar la agitación se
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tomó el tubo cerca del extremo superior con los dedos índice y pulgar y se golpeó
suavemente la base del mismo sobre el dedo índice de la otra mano con una amplitud
de 5cm. Otra forma consistió en hacer rotar los tubos entre las palmas de las manos.
Para medio solido:
Cuando el medio de cultivo a sembrar era sólido, según fuera el caso, se sembró en
superficie, en profundidad o en profundidad y superficie.
En superficie:
Por estría: se introdujo el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el
fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte,
luego se movió el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en
zigzag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.
Por trazo: se introdujo el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y se trazó
una línea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior, sin
ejercer presión para que no se rompa el medio.
Técnica de transferencia en placa Petri en superficie:
Por estría central: Se levantó la tapa lo suficiente como para permitir la introducción
del asa con la carga de microorganismos, iniciándose la estría en el borde del medio más
alejado del operador y se la extiende hasta llegar al centro de la placa, luego se gira ésta
180º y se continúa realizando otra estría de la misma manera. Esta división evita el
obstáculo del borde de la placa.
Figura 4
Muestras (Izquierda) y Siembra de bacteria en agar sangre (Derecha)
Fuente: Fotografía tomada por el autor (2022).
Por estría en cuadrantes: Se dividió la placa en cuatro sectores y se sembró en estría
cada uno de ellos, partiendo del borde de la placa hacia el centro. El cuadrante sembrado
debió ser el más alejado del operador y el inóculo en cada caso puede ser el mismo (la
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misma especie) o distinto (diferente especie) para cada cuadrante.
Aislamiento de cepa por agotamiento en superficie en una placa
El objeto es obtener cultivos en estado puro, operación
imprescindible y previa al estudio e identificación de una especie
bacteriana.
Se pueden realizar aislamientos por métodos generales y por
métodos especiales.
Se preparó una placa Petri con el medio de cultivo a la que se le
elimina el exceso de humedad, dejando la placa invertida 24h a
temperatura ambiente.
Se marcó la parte exterior de la contratapa de acuerdo al esquema.
Se cargó con el asa la muestra, y se depositó el inoculo en un punto de
la superficie del sector (I) cercano al borde, y se extendió en el mismo
con estrías próximas y paralelas. Seguidamente se quemó el asa y se
dejó enfriar.
Se giró la placa 90 º, se pasó el asa una vez sobre la última estría de
la región ya inoculada y se arrastró al sector (II) efectuando sobre él la
siembra sin superponer las estrías con las realizadas antes.
Se quemó nuevamente el asa y de la misma manera se estrío el
sector (III). Luego de quemar el asa, en el sector (IV) se realizaron estrías
con el material que se arrastró de (III), más amplias y que terminan en el
centro de la placa.
Figura 5
Transferencia por estría central (Izquierda), Transferencia por estría en cuadrantes
(Centro) y Cuadrantes de aislamiento por agotamiento (Derecha)
Fuente: Elaboración propia de los autores (2022).
Caracterización de las bacterias.
Descripción Macroscópica: Se describieron todas características físicas de las
colonias observables a simple vista sin el uso de un microscopio; estas son: la morfología
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de la colonia, forma, tamaño, elevación, color, borde, apariencia, aspecto y acompañada
de registros fotográficos.
Descripción Microscópica: Para esta descripción mediante el uso del microscopio, se
aplicó la coloración de Gram para determinar tipo de pared y la morfología de las células
bacterianas, así como el tipo de disposición de las bacterias, mediante observación
microscópica con el objetivo de 100X con aceite de inmersión.
Características y pruebas bioquímicas
Tinción de Gram
Se utilizó tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para
poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana,
considerándose bacterias Gram positivas a las que se visualizan de color violeta,
y bacterias Gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella. Se
comprobó la pureza de la colonia aislada realizando una tinción o coloración de Gram.
Para ello se pica la colonia y se la identifica con una marca en el fondo de la placa con
un número identificatorio. Se hizo un extendido en una lámina porta objeto con parte de
la colonia y si todas las células observadas coincidían morfológicamente, se repicaba el
resto de la colonia en una capsula con agar en estría para obtener un cultivo puro.
A veces la igualdad morfológica en la coloración de Gram puede ser engañosa por
existir bacterias de diferentes especies (pero iguales morfológicamente) presentes
dentro de la colonia seleccionada, pero en muy bajo número debido a su imposibilidad
de desarrollar.
Materiales: Microscopio, Mechero, Aguja bacteriológica, Lámina de vidrio porta objeto,
Violeta de genciana, Lugol, Alcohol acetona, Safranina.
Procedimiento:
Se esterilizo el asa bacteriológica, la cual será utilizada para
recoger las bacterias, empleando el mechero.
Se recogió una muestra del cultivo y se colocó sobre la lámina
de vidrio porta objeto.
Se fijó la muestra por calor pasándola rápidamente por el
mechero cortando la llama de arriba abajo tres (3) veces.
Se aplicó el colorante primario, Violeta de Genciana, sobre la
muestra y se esperó 1 minuto.
Se enjuagó con agua de chorro.
Se colocó lugol que actúa como mordiente y se esperó 1
minuto.
Se hizo la decoloración con el uso de alcohol acetona,
agregando hasta dejar de emitir color violeta.
Se enjuago con agua nuevamente.
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Por último, se agregó a safranina, colorante de contraste y se
esperó a 1 minuto.
Se lavó con agua y se dejó secar
Se observó en el microscopio a 100X con aceite de inmersión
para determinar morfológicamente si son Gram positivas o Gram
negativas, además de buscar la presencia o no de esporas.
Figura 6
Toma inóculo para coloración de Gram
Fuente: Elaboración propia de los autores (2022).
Posición de la Espora
Luego de realizada la coloración de Gram, con el uso de un microscopio se pudo
observar que la posición de la espora es central.
Oxidasa
Es una prueba para determinar si las bacterias producen las citrocromos c oxidasa,
se utilizó a papel de filtro impregnado con el reactivo n-tetrametil -p- fenilendiamina, el
reactivo pasó a un color purpura al ser oxidado y transparente al ser reducido.
Procedimiento:
Al papel de filtro impregnado con el reactivo n-tetrametil -p- fenilendiamina, se le
transfirió una porción del crecimiento bacteriano y se observó a el filtro de papel por unos
minutos, si presenta color purpura el resultado es positivo y si no presenta color la prueba
es negativa.
Catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias
facultativas que contienen citocromo c (a excepción del género Streptococcus). Dicha
enzima descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y agua, las bacterias
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que carecen del sistema citrocomo no producen catalasa por lo cual no descomponen el
peróxido de hidrógeno siendo tóxico para la bacteria, tal es el caso de ciertos organismos
anaerobios (Clostridium). La producción de catalasa se usa para diferenciar cocos Gram
positivos de los géneros Streptococcus (catalasa negativa) del Staphylococcus (catalasa
positiva).
Procedimiento:
Se Incubo un tubo con caldo tripticasa con una o varias asadas de un crecimiento
bacteriano, se incubo por 24 horas a 37ºC. Finalizada la incubación, se agregó a cada
tubo cinco gotas de solución de agua oxigenada (peróxido de hidrógeno). La reacción
positiva se manifiesta por el desprendimiento de burbujas de gas (oxígeno desprendido
del H2O2.) En lugar del caldo puede o usarse también agar nutritivo.
Fermentación de la glucosa (Interpretación del Kligler)
Es el medio diferencial en tubo más útil en el estudio de bacilos GRAM negativos
intestinales (enterobacterias) permitiendo su diferenciación, sobre la base de la habilidad
de fermentar la glucosa o lactosa y la capacidad para producir hidrógeno sulfurado (H2S)
y gas. Este medio contiene en su preparación: rojo fenol como indicador de la producción
de ácido y sulfato ferroso para detectar la producción de hidrógeno sulfurado.
Procedimiento:
Un cambio amarillo en el fondo (taco) del tubo indica fermentación de la glucosa y si
se observa en el bisel, revela fermentación de la lactosa. La producción de gas en la
fermentación se observa por presencia de burbujas entre el medio y la pared del tubo, la
producción de H2S se demuestra con un ennegrecimiento del medio.
Movilidad
Para detectar la presencia o ausencia de flagelos, se usó un medio semisólido
(contiene agar en una proporción de 0,3 %). Se siembra por punción única con la aguja,
sin tocar el fondo. La movilidad se manifiesta macroscópicamente, por una zona difusa
de crecimiento diseminada a lo largo de la línea de inoculación.
Utilización del Citrato
Esta prueba sirve para determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como
única fuente de carbono para sus procesos metabólicos. Para ello se utiliza el citrato de
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Simmons, medio que contiene citrato de sodio como única fuente de carbono, Las
bacterias que utilizan el citrato, lo pueden desdoblar mediante una enzima, citratasa o
citrato desmolasa; dichas bacterias capaces de desdoblar el citrato también pueden
utilizar las sales de amonio presentes en el medio como fuente única de nitrógeno,
produciendo alcalinidad, lo cual es evidencia por el cambio de color del indicador de azul
de bromotimol (verde en neutro, azul en alcalino).
Procedimiento:
Se sembró un tubo con agar citrato de Simmons, (verde) usando un inóculo ligero. Se
Incubo a 37ºC por 24 horas. Si la bacteria metaboliza el citrato alcaliniza al medio: (color
azul, citrato positivo), mientras aquellas que ni lo metabolizan no crecen en el medio el
cual permanece con su color original, verde (citrato negativo).
Figura 7.
Vista microscópica de la forma esporulada de la bacteria (Izquierda). Extendido
muestra para observación (Derecha).
Fuente: Fotografía tomada por el autor (2022).
Criterios para la dosificación de la solución adicionada con bacterias a ser
colocada en las fisuras del concreto.
Se proponen dos formas de dosificación de las bacterias en la mezcla de concreto y
sus respectivos criterios de ejecución, las cuales son:
1.-Preparación de una solución gelatinosa adicionada con bacterias:
Se realiza el cultivo de la bacteria y se coloca en un medio semilíquido con contextura
gelatinosa, cuya finalidad es ser colocada en la superficie de las fisuras del concreto, de
manera que esta se mantenga por un tiempo y las bacterias puedan realizar su trabajo.
Se debe elegir un medio que sea apto, de acuerdo a las necesidades y disponibilidad,
que permita el adecuado desarrollo de los microorganismos. Debe ser un medio libre de
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contaminantes y se debe tener cuidado a la hora de la realización del cultivo de no
contaminar la muestra.
Para realizar una solución adicionada con bacterias se puede seguir el siguiente
procedimiento: Se agrega aproximadamente 12,5g de caldo nutritivo a un frasco de
500ml que contiene agua destilada. Luego se cubre con un tapón de algodón grueso y
se hace hermético con papel y goma. Luego se esteriliza con una olla durante
aproximadamente 10-20 minutos. Ahora la solución está libre de contaminantes y la
solución es de color naranja claro antes de la adición de la bacteria. Posteriormente se
abren los matraces y se agrega exactamente 1 ml de la bacteria al matraz esterilizado y
se mantiene en un agitador a una velocidad de 150-200 rpm durante la noche. Después
de 24 horas, se encontró la solución bacteriana. Para la realización del caldo nutritivo
debe procurar recrear las condiciones naturales que suceden sobre el concreto, en
donde sus condiciones sean lo más similares que se pueda, al igual que las soluciones
con pH y demás factores.
2.-Introducción de capsulas en la mezcla de concreto adicionadas con
microorganismos:
Uno de los problemas principales de las fisuras es que no se sabe cuándo y dónde
aparecerán, a diferencia del modelo anterior, en este modelo no se necesita revisar
constantemente.
Figura 8
Preparado y siembra de inóculos en probetas
Fuente: Fotografía tomada por el autor (2022).
Seguidamente, en se procede a la búsqueda de capsulas de acetato las cuales suelen
conseguirse vacías, y se utilizarán para almacenar la bacteria, la cual estará encapsulada
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con el alimento hasta que esta se rompa por acción de la humedad del ambiente al
penetrar por la fisura, esta humedad hace que se active la bacteria y pase de su forma
esporulada a su forma vegetativa para que luego empiece el proceso de reparación de
la fisura. El alimento de las bacterias depende de que especie de Bacillus sea, por lo que
previamente se debe realizar un estudio de identificación de la especie Bacillus.
Resultados
Al realizar la primera siembra en el medio solido agar sangre por el método estría en
cuadrantes en placas de Petri, estas divididas en cuatro cuadrantes, proveniente de
inóculos tomados con la ayuda de un aplicador de madera directamente de las nueve (9)
muestras tomadas. Posterior a la incubación se observaron diversidad de colonias
presentes en estas. Seguidamente, se tomó muestra de cada colonia para elaborar
extendidos, fijar y aplicar la coloración de Gram para determinar la morfología de los
microorganismos presentes. Se observaron microscópicamente la presencia de diversas
formas bacterianas, de tipo Gram positivo y Gram negativo, muchas de estas,
presumiblemente por defecaciones de animales y otras bacterias ambientales.
Por otro lado, solo en las muestras 1, 2 y 9 se observó el crecimiento de colonias
similares a las del género Bacillus por sus características macroscópicas y microscópicas
(con presencia de esporas), igualmente se observaron formas esporuladas de estas, las
cuales son de gran interés para nuestro estudio, debido a que las esporas de las
bacterias entran en contacto directamente con el agua y los nutrientes lo cual provoca
que se active la bacteria que comienza a alimentarse de lactato de calcio convirtiéndose
en caliza que se solidifica en la superficie de la fisura sellándola. (Fayerwayer, 2015) Las
esporas de Bacillus cohnii son capaces de permanecer vivas en el hormigón hasta
doscientos años y, en teoría, pueden prolongar la vida útil de la estructura durante el
mismo periodo.
Esto es casi cuatro (4) veces más que los 50-70 años de vida útil del hormigón
convencional. Una vez encontrada y aislada la bacteria Bacillus en su forma esporulada
como se observa en la figura 7, era necesario ver su comportamiento y aporte de las
mismas en la reparación de fisuras. Para ello tomaron tres probetas estándar de 150 x
300 mm de concreto con resistencia f`c 250 kg/cm2; a estas se les hicieron de forma
mecánica-manual con la ayuda de una segueta dos surcos en su superficie semejante a
una fisura de 2 mm de anchura por 6 cm de largo. Se hicieron los ensayos en estado
seco en dos de ellas y una en estado húmedo-saturado, donde se aplicó un mililitro (1
ml) de las bacterias cultivadas en caldo soya tricticasa de la muestra 2 y 3.
En una de las fisuras con solo la solución Ringer Lactato y otra con agar adicionado
con ringer lactato; las secas se dejaron en incubadora a 37 ˚C y se observaron
microscópicamente en 24 y 48 horas. Durante ese tiempo se humedecía con ringer
lactato; la húmeda saturada en agua, se dejó sumergida 24h y al día siguiente se le aplico
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la espora humedeciendo la fisura con ringer de la muestra 1 y con agar muestra 2, se
dejó a temperatura ambiente. Para las observaciones, se sacaron las probetas de la
incubadora, se inoculo en solución fisiológica con un aplicador estéril solo para
humedecer frotando la superficie en dos direcciones a la izquierda y la derecha, para
luego sembrarlo en un caldo de soya tricticasa, con otro hisopo se froto alrededor del
surco.
Se hizo un frotis con las muestra para hacerle un extendido y aplicarles la tinción de
Gram, esto se hizo con la intención de poder observar la existencia de bacterias viables
y resistentes a ese ambiento; satisfactoriamente se determinó que si son viables por que
crecieron en el caldo nutritivo soya. Posteriormente se sembraron nuevamente en
medios de cultivos disponibles para ver si se reproducían, al observar las muestra a las
24 horas se visualizó crecimiento de las colonias en los cultivos. Se recomienda
enfocarse en los porcentajes más altos y a partir de estos buscar una concentración
optima de bacterias para llegar a la más alta resistencia alcanzada a partir de la inclusión
de bacterias Bacillus.
Para encapsulación, las investigaciones futuras deben enfocarse en métodos para
evaluar la supervivencia de las esporas después de la incorporación a materiales
cementosos, y optimizar la cantidad y el tamaño de las cápsulas para lograr la
autocuración deseada sin una significativa reducción de la resistencia física
(Fahimizadeh et al., 2020).
Discusión
La capacidad de autocuración del hormigón se ha mejorado mediante la incorporación
de bacterias, (Erlich 1996) pudiendo inducir la precipitación de carbonato de calcio a
través de su actividad metabólica. Acumulándose en los precipitados, formando un sello
eficaz contra la entrada de agua relacionada con las grietas. Henk M. Jonkers y Erik
Schlangen presentaron su investigación en la Primera Conferencia Internacional sobre
Materiales de Autocuración celebrada en abril de 2007 en los Países Bajos, utilizando
con éxito las bacterias formadoras de esporas alcalifílicas como un agente de
autocuración en hormigón. Siendo los primeros en incorporar bacterias dentro de la pasta
de cemento para el desarrollo de hormigón autocurativo. concluyendo que las bacterias
agregadas directamente a la pasta solo permanecieron viables durante 4 meses.
Estudios posteriores vieron como Jonkers (2011) usaba partículas de arcilla
expandida y Van Tittlelboom (2011) usaba tubos de vidrio, para proteger las bacterias
dentro del concreto. Desde entonces, creándose otras estrategias para proteger las
bacterias (Wang et al. 2012).
Haciéndose mención a las aplicaciones de autorreparación basadas en microcápsulas
extendidas a materiales de recubrimiento de base biológica, el proceso fue exitoso. Asi
como, los recubrimientos basados en aceite de neem, con otro carácter de base
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biológica, debido a que utiliza aceite vegetal como material central (Chaudhari et al.
2013).
Los materiales incorporados con bacterias son capaces de sellar grietas mediante la
producción de cristales de CaCO3, que pueden bloquear las micro fisuras y los
microporos del hormigón (Samani y Berenjian, 2016). El CaCO3 puede precipitarse
mediante un proceso de mineralización inducido biológicamente en presencia de una
fuente de calcio.
En este proceso, los microorganismos producen carbonato extracelularmente a través
de varias vías metabólicas, incluida la metanogénesis no metilo trófica, la fotosíntesis
oxigénica y anoxigénica, la utilización de ácidos orgánicos. El proceso de curación de
grietas del concreto bacteriano depende de la disponibilidad de nutrición y supervivencia
de las bacterias (Paravano et al, 2019).
El uso de selladores microbianos a través de la precipitación mineral dentro del
concreto es una técnica prometedora para disminuir los poros internos y también actúa
como un tratamiento de protección superficial alternativo (o técnica de recubrimiento) que
se puede aplicar a la superficie del concreto (Sotomayor, 2020). Los tratamientos de
grietas dentro del concreto generalmente se llevan a cabo en forma de tratamientos
activos y pasivos.
El hormigón bacteriano, que se refiere al uso de bacterias como suplemento curativo
o material de sustitución parcial del agente aglutinante (por ejemplo, cemento Portland),
es un método novedoso con usos potenciales en ciertas secciones estructurales (Galán
y García, 2011). No obstante, a pesar de sus importantes beneficios, este material tiene
un costo de producción variable e implicaciones ambientales (Samani y Berenjian, 2016).
Conclusiones
Mediante análisis microbiológicos se logró detectar la presencia de bacterias en las
muestras de suelo recogidas de la mina de calcita perteneciente a la empresa
Venezolana de Cementos SACA. y en la muestra obtenida de la Calera. Determinando
que las bacterias aisladas de las muestras de suelo son bacilos, Gram positivos, capaces
de producir esporas, pertenecientes a género Bacillus, tal como en los antecedentes que
inspiraron este trabajo. Pendiente la identificación de especie, al obtener los recursos
necesarios. La elaboración de medios de cultivo permite el crecimiento de las bacterias
del género Bacillus, diferente al medio de agar sangre, el cual se usa normalmente para
el aislamiento de especies de interés médico.
Los resultados de los análisis realizados a partir de muestras de suelo indican que las
bacterias presumiblemente tienen la capacidad de adaptarse al medio, multiplicarse
potencialmente, en presencia de lactato de calcio, pudieran liberar como producto de su
metabolismo, carbonato de calcio, material que serviría para auto reparar fisuras. Esto
se debe principalmente a que estas bacterias del género Bacillus se encuentran en su
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forma esporulada en minas de calcita, de donde se extrae la materia prima para la
elaboración del cemento y de la cal. A nivel de pregrado no será posible lograr todos los
objetivos planteados, por limitaciones de tiempo y carencia de recursos indispensables
para conocer con certeza el material que producen las bacterias halladas; lo que
permitiría conocer si tienen la capacidad o no de auto reparar fisuras, a través de pruebas
de ensayo y error reiterativas, hasta obtener un resultado aceptable.
Durante la investigación se planteó dos modelos de dosificación de las bacterias para
su adicción a las mezclas de concreto en capsulas disolvibles de acetato o en obras
existentes empleando una solución gelatinosa; por lo que se sientan las bases y criterios
para continuar con la investigación. Hasta donde conocemos, este documento es el
primer reporte sobre bacterias y su aporte a la auto reparación de fisuras en Venezuela
y corresponde a un aporte básico para los programas de investigación tanto regional
como nacional.
Agradecimientos
Agradezco a la Dra. Isabel Álvarez por haber facilitado tanto sus conocimientos como
los equipos e instrumentos necesarios para la realización de las labores de laboratorio.
Al Ing. Juan Espinoza (QEPD) por su interés en la investigación, y su ayuda en el ensayo
de las probetas de concreto realizadas en el estudio.
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